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影響電泳加工質量的因素分析

2022-09-01

影響電泳加工質量的因素分析

1.電泳介質的pH值東莞電泳加工溶液的pH值決定帶電物質的解離程度,也決定物質所帶凈電荷的多少.對蛋白質,氨基酸等相似兩性電解質,pH值離等電點越遠,粒子所帶電荷越多,泳動速度越快,反之越慢。因而,當別離某一種混合物時,電泳加工應選擇一種能擴大各種蛋白質所帶電荷量差其他pH值,以利于各種蛋白質的有用別離.為了確保電泳過程中溶液的pH值安穩,有必要采用緩沖溶液。

2.緩沖液的離子強度溶液的離子強度(Ionintensity)是指溶液中各離子的摩爾濃度與離子價數平方的積的總和的1/2.帶電顆粒的遷移率與離子強度的平方根成反比。低離子強度時,遷移率快,但離子強度過低,緩沖液的緩沖容量小,不易保持pH安穩.高離子強度時,遷移率慢,但電泳譜帶要比低離子強度時細窄。一般溶液的離子強度在0.02~0.2之間。不同帶電顆粒,因其所帶電荷的性質和多少、形狀和巨細等差異,使其在同一電場強度、相同的支撐介質和緩沖液的條件下,各自的泳動速度不同,然后使各種不同的帶電顆粒如蛋白質、核酸等生物大分子得以別離。帶電顆粒在電場中泳動速度以遷移率(mobility)表明。故遷移率可定義為帶電顆粒在單位電場強度下的泳動速度,是指在1V/m的電場效果下,帶電顆粒每秒鐘移動的間隔(m),其移動速率為m/s,遷移率以m2/(V?s)表明。而在實踐使用中以cm2/(V?s)表明,因而經過測量d、l、V、t,便可核算遷移率。I=1/2∑CiZi2(I:離子強度;Ci:離子的摩爾濃度;Zi:離子價數.)0.154MNaCl溶液的離子強度為:I=1/2(0.154×12+0.154×12)=0.1540.015MNa2SO4溶液的離子強度為:I=1/2(0.015×2×12+0.015×22)=0.045

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3.電場強度東莞電泳加工電場強度(電勢梯度Electricfieldintensity)是指每厘米的電位降(電位差或電位梯度).電場強度對電泳速度起著正比效果,電場強度越高,帶電顆粒移動速度越快。依據實驗的需求,電泳可分為兩種:一種是高壓電泳,所用電壓在500~1000V或更高.因為電壓高,電泳時間短(有的樣品需數分鐘),適用于低分子化合物的別離,如氨基酸,無機離子,包括部分聚焦電泳別離及序列電泳的別離等。因電壓高,產熱量大,有必要裝有冷卻設備,不然熱量可引起蛋白質等物質的變性而不能別離,還因發熱引起緩沖液中水分蒸騰過多,使支撐物(濾紙,薄膜或凝膠等)上離子強度增加,以及引起虹吸現象(電泳槽內液被吸到支撐物上)等,都會影響物質的別離.另一種為常壓電泳,產熱量小,室溫在10~25℃別離蛋白質標本是不被損壞的,無需冷卻設備,一般別離時間長。電場強度是指每1厘米的電位降,故又稱電位梯度,以V/cm表明。電場強度對泳動速度起決定性效果。在必定范圍內,電場強度愈高,帶電顆粒泳動愈快,依據不同電泳所需電場強度,可分為常壓電泳和高壓電泳。常壓電泳一般在100~500V,高壓電泳一般為500~10000V。紙電泳、醋酸纖維電泳、聚丙烯酰胺和瓊脂糖凝膠電泳只需200~500V,而固相pH值梯度等電聚焦電泳則需求3000~5000V高壓。電壓與支撐介質的長度有關,而電流與支撐介質的橫截面(或寬度)成正比。大部分電泳用恒壓控制電場強度。在做管狀圓盤電泳時,一般用調節每管的電流(mA)控制電場強度,在電泳過程中,保持安穩的電場強度或安穩的電流,是電泳成功與否的重要條件。

4.電滲現象東莞電泳加工在電場中液體關于一個固體的固定相相對移動稱為電滲.在有載體的電泳中,影響電泳移動的一個重要因素是電滲。常遇到的情況是γ-球蛋白,由原點向負極移動,這是電滲效果所引起的倒移現象.發生電滲現象的原因是載體中常含有可電離的基團,如濾紙中含有羥基而帶負電荷,與濾紙相觸摸的水溶液帶正電荷,液體便向負極移動。因為電滲現象往往與電泳同時存在,所以帶電粒子的移動間隔也受電滲影響;如電泳方向與電滲相反,則實踐電泳的間隔等于電泳間隔加上電滲的間隔.瓊脂中含有瓊脂果膠,,其中含有較多的硫酸根,所以在瓊脂電泳時電滲現象很明顯,許多球蛋白均向負極移動。除去了瓊脂果膠后的瓊脂糖用作凝膠電泳時,電滲大為減弱.電滲所造成的移動間隔可用不帶電的有色染料或有色葡聚糖點在支撐物的中心,以調查電滲的方向和間隔。

5.分子篩效應在不同濃度和交聯度的凝膠中,其孔徑巨細不同,經過分子篩效應可將不同巨細的顆粒進行別離,其別離機制是小分子經過凝膠微孔,而大分子顆粒難經過微孔而使遷移阻滯,然后將被別離的顆粒,按分子巨細的順序排列進行別離。


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